Diabetologia：激活但功能受损的记忆Tregs在1同型糖尿病患者进展缓慢的过程中逐渐扩展

从第一次显现肝细胞内免疫性到显现1DF心血管疾病诊断病征的的发展率在成人初期就有很好的详细描述，多个肝细胞内免疫性无症状的成人中的有70%在抗质转换后10年内患上心血管疾病，而随访15年的成人这一比率减低到84%。相对于之下，占诊断1DF心血管疾病一半以上的DF1DF心血管疾病的发病机制还没有得到充分的系统地研究。

更加多的人开始采用分前期系统来定义1DF心血管疾病的的发展：个质在显现多种肝细胞内免疫性时转至第1前期，显现血糖异常时转至第2前期，显现病征时转至第3前期。一些多发肝细胞内免疫性无症状的个质，在1期和2期，的发展较慢，并发展为发病的1DF心血管疾病。我们以后详细描述了一组成员在首次侦测到多种肝细胞内免疫性比对后至少10年无心血管疾病的却是慢的发展者，这组成员病症人数少，但特性极其明确。随后，我们注意到肝细胞内自身肝细胞特异性CD8+T细胞内自由基在的发展很慢的病症中的基本不实际上，但在近来发病和长期实际上的心血管疾病病症中的很容易侦测到。这显然断定，与的发展病症相对于，这些病症自身病原质的调节弱化。

早期系统地研究断定，尽管调节性T细胞内(Treg)存量正常，但心血管疾病病症实际上一些特性缺陷，其中的包含对IL-2的自由基技能降低。此外，心血管疾病病症中的的不稳定性该CD4+T细胞内显然对调节增添抵抗性，显出为不稳定性该T细胞内的抑止减弱，大自然转化成的Treg和质外转化成的诱导Treg，以及肝细胞经历的CD4+T细胞内中的IL-2自由基减弱。本系统地研究的意在是详细描述了CD4+调节性T细胞内(Treg)在领头却是很慢的发展者中的的特性，他们的平均年龄组为43岁(31-72岁)，随访时间为18-32年。

方法：BOX系统地研究是一项以人群为基础的垂直系统地研究，在21岁以下患病的病症亲属中的检查1DF心血管疾病的危险因素。我们以后详细描述了长期很慢的发展者的特性，他们保有多重肝细胞内免疫性无症状有约10年，但没有显现心血管疾病的诊断病征，慢性或非展开性免疫性。随后，10名继续保有无心血管疾病并不愿给予大量血液循环比对的很慢的发展者归属于T和B细胞内特性分析。在现阶段的系统地研究中的，8名慢的发展者(SP组成员)，中的位年龄组43岁(31-72岁)，18 - 32岁之间的肝细胞内免疫性无症状。所有的发起者都属于1DF心血管疾病的发展的1期，尽管一些人随后挽回了肝细胞内免疫性对某些肝细胞的无症状自由基，然而，一名病症以后属于2期至少6年，但没有显现诊断病征，一名病症被确诊为心血管疾病，该受试者72岁，在搜集实验比对时，其HbA1c下降时到53 mmol/mol(7%)，在系统地研究小组成员中的对该供质展开了单独风险评估。分离外周血单个核细胞内(PBMCs)，采用多参数流式细胞内拳法和T细胞内抑止试验风险评估供质中的Treg的kHz、表DF和特性。采用FlowSOM和CITRUS(聚类鉴定、表征和回归)展开无行政官员聚类分析，风险评估Treg表DF。

结果：与健康供质相对于，来自慢的发展质的思绪CD4+T细胞内的行政官员聚类推测，激活的思绪CD4+ TregkHz减低，与糖皮质激素诱导的TNFR相关复合物(GITR)隐含减低有关。一名HbA1c下降时的病症与的发展很慢者和匹配的对照组成员相对于，Treg谱有所并不相同。特性分析断定，与健康供质相对于，来自很慢的发展质的Treg激活的CD4+不稳定性该T细胞内抑止明显损害。显出为对不稳定性该CD4+T细胞内CD25和CD134隐含的抑止减低。

三幅1 系统地的表DF分析推测，CD4+Treg亚DF在慢的发展缓冲区中的减低。由FlowSOM填充的Treg室，聚集在来自所有供质的活CD4+CD45RA -细胞内上。根据标示出物隐含鉴定出10个元簇:思绪T细胞内_1;思绪T cell_2;思绪T cell_3;思绪T cell_4;CD49b思绪T细胞内;HLA-DR + GITR +思绪T细胞内;终点站程Treg_1;终点站程Treg_2;终点站程Treg_3;和终点站程Treg_4。(a)采用9个并不相同Treg标示出填充的10个元簇的MST。每个数据流都有一个坦克部队(100个坦克部队)，更大的元坦克部队(10个元坦克部队)在数据流组成员周遭着色。每个数据流中的的糕点三幅对此单个标示出的隐含级别。(b)每个元聚类的热三幅，以推测整质标示出隐含。(c, d)为HD组成员(c)和SP组成员(d)填充三幅，以及FlowSOM识别系统的每个元簇的裂口。(e-l)相对丰度为每个metacluster木箱终点站三幅(丰度> 0.05%)确定为HD和SP组成员:终点站程Treg_2 (e),终点站程Treg_3 (f),终点站程Treg_4 (g), HLA-DR + GITR +思绪T细胞内(h)、思绪T cell_1(i),思绪T cell_2 (j),思绪T cell_3 (k) n d CD49b思绪T细胞内(l)。绿色左上方都有捐助者SP 606。**p< 0.01, Wilcoxon配对符号秩检验。此键适用于三幅形部分(a)， (c)， (d)和d (e-l)

三幅2 采用CITRUS的预测模DF证实，TregkHz的减低是的发展很慢的标志。分级门控(a - f)和柑橘分析(g-k)比较SP发起者和匹配的HD发起者在CD4+CD45RA−T细胞内上的差异。(a)子代CD25+ cd127 lotreg和CD25loCD127+T c e l群质的近现代三幅。CD25+ cd127lotreg被CD39和FOXP3掺入，然后通过HLA-DR和GITR隐含展开分离，模拟FlowSOM群质。(b) HD(小点)和SP(蓝点)组成员以及供质SP 606(绿色)中的CD25+ cd127的kHz综合三幅。(c-f) CD25+CD127loCD39+FOXP3+和CD25loCD127+门控弟集的木箱终点站三幅;(c) HLA-DRloGITR−(终点站程Treg_2)， (d) HLA-DRintGITRlo(终点站程Treg_3)， (e) HLA- d RhiGITR+(终点站程Treg_4)， (f) HLA- d RhiGITR+(HLA-DR+GITR+终点站程T cell)。(g - i)柑桔簇锥形由(g) CD127， (h) CD25和(i) FOXP3隐含强度着色，箭头醒目的簇被识别系统为SP和HD缓冲区之间的并不相同。(j)木箱终点站三幅推测了在SP(蓝点)和HD(灰点)组成员中的，CITRUS思绪Treg_3和Treg_4的相对丰度(比率)。(k)直方三幅推测每个簇的表DF(粉红色)和Treg标示出相对隐含与历史背景隐含(黄色);上列，终点站程Treg_3;下面一行，终点站程Treg_4。历史背景与所有其他簇中的标示出的隐含有关。*p< 0.05， **p< 0.01, Wilcoxon配对符号秩检验

三幅3 与健康献血者相对于，的发展很慢者思绪treg的GITR减低。每个思绪CD4+T细胞内元簇(思绪T细胞内_1;思绪T cell_2;思绪T cell_3;CD49b +思绪T细胞内;HLA-DR + GITR +思绪T细胞内;终点站程Treg_2;终点站程Treg_3;来自FlowSOM的memory Treg_4)侦测每个隐含标示出的变化。(a,b)来自HD (a)和S (b)缓冲区的隐含热三幅(sp606不包含在内)。(c,d)思绪Treg_4元簇中的所有HD(灰色)、所有SP(黄色)和SP 606(绿色)的FlowSOM GITR隐含串联，推测直方三幅(c)和综合三幅(d)。Wilcoxon配对符号秩和检验，p< 0.07(绿色)所有供质包含，p< 0.05(黄色)供质SP 606和匹配的HD不包含在测试中的。(e,f) HLA-DRhiGITR+Tregs中的GITR隐含，从分级门控，从所有HD(灰色)、所有SP(黄色)和SP 606(绿色)串联，推测直方三幅(e)和综合三幅(f) *p< 0.05, Wilcoxon配对符号秩检验

三幅4 来自很慢的发展的CD4+ treg细胞内控制不稳定性该CD4+T细胞内的技能降低。SP组成员用黄色的终点站和左上方对此，HD组成员用金色的终点站和左上方对此，绿色的终点站/左上方对此供质sp606。采用CD4+CD25+ Treg分选试剂盒对CD4+T细胞内展开分选。CD4+CD25−(反之亦然者)被标示出为CFSE, Treg按仔细观察的比率滴定。用抗CD3 /28微珠激活细胞内，培育3天后展开流式细胞内拳法侦测。(a-d)与CD4+反之亦然者相对应该的treg培育(自质)(e-h) HD、SP或SP 606 Treg与HD反之亦然者培育。(a,b,f) CFSE凋亡(a,e)和CFSE抑止百分比(b,f)。(c, d,h) CD25 (c,g)和CD134 (d,h)的抑止百分比。采用无症状对照(激活的积极响应该细胞内不含treg)量化抑止百分比。*p< 0.05， **p< 0.01， ***p< 0.001，重复测量双向方差分析。†p < 0.0 5 Bonferroni的事后多重比较测试

三幅5 不稳定性该CD4+T细胞内对很慢的发展的T细胞内激活的抑止更引人注目。SP组成员用黄色的终点站和左上方对此，HD组成员用金色的终点站和左上方对此，绿色的终点站/左上方对此供质sp606。采用CD4+CD25+Treg分选试剂盒对CD4+T细胞内展开分选。CD4+CD25−(反之亦然者)被cfsel标示出，treg按仔细观察的比率滴定。用抗CD3 /28微珠激活细胞内，培育3天后展开流式细胞内拳法(CD25反染)和细胞内因弟分析。HD Treg与HD、SP或sp606反之亦然者协同培育。(a,b) CFSE凋亡(a)和CFSE抑止花红(b)。(c,d) CD25抑止花红(c)和CD134抑止花红(d)。(e,f) IFN-γ(e)和IL-17A (f)在共培育中的的隐含。***p< 0.001， **p< 0.01，重复测量双向方差分析。†p < 0.0 5 Bonferroni的事后多重比较测试

论点：我们得出的论点是，来自很慢的发展弟的激活思绪CD4+Treg在GITR隐含中的得到了扩展和丰富，强调了进一步系统地研究Treg在1DF心血管疾病风险个质中的的关联性的必要性。

中有中有：

Boldison J, Long AE, Aitken RJ,et al.Activated but functionally impaired memory Tregs are expanded in slow progressors to type 1 diabetes.Diabetologia 2021 Oct 28